为什么做的western最后都没有显出影啊？

 在两个实验室遇到过ECL试剂盒出问题，第一次是前人用试剂盒时吸取液体没有换枪头，试剂盒污染；第二次是师兄用下来的试剂盒，开封日期已经2年，最后验证是试剂盒失效，换了试剂盒之后就曝出很漂亮的条带，浪费了我半个月时间。我遇到同样的问题是从头找起的：先用考马斯亮蓝染胶看看胶上有没有蛋白，排除蛋白被降解，如果没有问题，再用考马斯亮蓝染转膜后的膜，可以看到膜上是不是有蛋白，如果还没有问题，就要注意二抗是不是和一抗吻合的，二抗要用HRP标记的，这还没有问题的话，换个ECL试剂盒试试吧，如果涂ECL之后能看到条带的话说明前面都没有问题，最后的问题可能是胶片曝光了，显影液、定影液出问题了。

如果你的实验条件都没变的话，有可能是蛋白反复冻融降解了，或者抗体失活。也有可能是显影定影剂放久了，一般有效期只有三个月，或者没有完全避光保持。至于你第一次做的内参不齐，考虑孵育抗体时没混匀，要让膜在密封袋里漂浮转动才行。

10%浓缩胶，4%分离胶，电泳80V30min，100V 120min.4%的胶跑这么长时间，估计蛋白都跑没了吧。建议你1：转完膜用丽春红或者快绿染色看一下蛋白有没有转过去           2：跑完的胶蓝染，看有没有条带。

在做western的时候，有一步的“质控”非常重要，就是转膜后的丽春红染色。这一步能鉴定你的蛋白是否已经转在膜上了。如果丽春红染色有条带，说明是后续的抗体杂交或者曝光的问题，如果丽春红染色都没有条带，说明问题出现在转膜之前的步骤，如蛋白样本出现问题、跑胶出现问题、转膜出现问题等。另外，做实验要弄清楚每一步的原理，你说“电泳过程中条带我看的很好，转膜我也感觉没有问题”，应该都是没有道理，而只是你的直觉的，想要真正找到原因，要一步一步来排查的。另外如果一点都没显影的话，应该不是牛奶浓度的问题，也应该不是抗体浓度的问题，这些只会影响你的显影质量而不会影响你是否出条带。

我觉得分离胶的浓度可以降点 电泳时间没必要那么长啊